Centre de recherche de JOUY-EN-JOSAS – Assistant Ingénieur

Assistant Ingénieur de 18 mois financé dans le cadre de l’appel à projet de recherche international « Innovations en Matière de Vaccin pour le bétail »
(Salaire brut mensuel 1800-2100€ en fonction de l’expérience)
Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires (UR892-VIM)

Contexte scientifique dans l’unité VIM (UR892) :

Ce projet s’inscrit dans le développement de nouvelles stratégies vaccinales « universelles » contre le virus de la grippe aviaire, chez l’hôte aviaire pour les éleveurs du continent Sud-Est Asiatique (le CRDI est un organisme à vocation humanitaire). La stratégie vaccinale sera ensuite étendue au développement de vaccin universel humain inducteur d’anticorps à large spectre, tant contre les souches de grippe saisonnière que pour parer l’émergence de souches virales à potentiel pandémique. Ce projet fait appel à 2 technologies de pointe développées dans les laboratoires partenaires : les nanorings (CC, VIM, France) et la protéine adjuvante P97c, ainsi que des nanofilaments (Pr. Denis Archambault, DA, UQAM, Canada). Les nanorings sont un nouveau type de vaccin sous-unitaire développé à l’origine au sein des équipes du Dr. Jean-François Eleouët, virologiste Moléculaire en collaboration avec le groupe d’immunologistes du Dr. Sabine Riffault (Tran et al., 2007 , J Gen Virol). Les nanorings sont constitués par la protéine de nucléocapside, N du virus respiratoire syncitial (RSV) ayant la propriété de s’auto-assembler pour former des anneaux d’une quinzaine de nm de diamètre sur lesquels il est possible de greffer des épitopes d’intérêt afin d’induire la production d’anticorps protecteurs. Il a ainsi été montré que l’instillation intra-nasale de nanorings couplés à un antigène d’intérêt est très immunogène et exacerbe la réponse induite contre l’épitope présenté par voie mucosale (production d’IgA spécifiques de l’antigène fusionné) (Roux et al., 2008, Rémot et al., 2012, PLoS One). Les nanorings ayant fait preuve de leur immunogénicité mucosale, nous avons donc envisagé d’utiliser ces nanoparticules comme support de présentation des antigènes d’intérêt d’autres virus respiratoires dont le virus de la grippe. Deux brevets INRA ont été déposés (WO 2006/117456 et WO/2007/119011). Ils couvrent la technique de purification de ces anneaux, leur utilisation en vaccination (1er brevet), et leur utilisation en tant que supports antigéniques pour d’autres protéines ou peptides (2ème brevet). Parallèlement à cela, il a été démontré à UQAM par l’équipe du Pr. DA que le domaine carboxy-terminal de la protéine P97 de mycoplasma hyopneumoniae fusionnée à un antigène viral a un effet adjuvant et augmente l’induction d’anticorps dirigés contre l’antigène présenté (US patent).

Descriptif du projet :

L’objectif de ce projet est de développer un vaccin universel contre la grippe aviaire ciblant dans un premier temps l’hôte aviaire afin de préserver l’activité des éleveurs et de diminuer indirectement les phénomènes d’émergence virale. Dans un second temps, la grippe étant zoonotique, l’objectif est de développer un vaccin contre la grippe saisonnière ou pandémique à partir d’épitope conservés du virus grippal. Au laboratoire, nous avons d’ores et déjà développé le modèle en greffant à l’extrémité C-terminale de la protéine N l’ectodomaine de la protéine M2 (M2e) du virus grippal, épitope très conservé quelle que soit l’origine de la souche virale (Hervé et al., 2014, J Virol). Nous avons ainsi confirmé les propriétés adjuvantes intrinsèques des nanorings N-3M2e (triple répétition du peptide M2e) et la protection bivalente à la fois contre le virus RSV et la grippe au cours d’une épreuve virale en modèle murin. Parallèlement, la détermination de la structure atomique de la N du
RSV nous a permis d’affiner le greffage d’épitope dans une boucle de la protéine permettant la stabilisation d’épitopes conformationnels (Hervé et al., 2016, Nanomedicine). Forts de ces expériences, nous souhaitons dans ce projet développer ce modèle vaccinal en greffant 2 épitopes « universels » : M2e (ectodomaine de la protéine de surface M2) et HA2 (domaine constituant la tige de l’hémagglutinine du virus grippal, protéine majeure de surface et antigène principal des virus grippaux). A ces épitopes viraux seront associés des peptides issus de la protéine adjuvante P97C (domaine C-terminal).

Le programme du projet peut être résumé ainsi :

– Construction, production et purification des nanorings : les constructions N-Epitope- Adjuvants seront testées afin d’optimiser leur capacité protectrice : séquences codonoptimisées, solubilité, rendement, stabilité des constructions N-3M2e-P97C, N-P97C- 3M2e, N-HA2-P97C et N-P97C-HA2, caractérisation (DLS, microscopie électronique,
western-blot…)

– Etude de la réponse immunitaire : en modèle murin, différentes doses de nanorings adjuvés ou non, seront instillés par voie nasale, après rappel l’analyse de la cinétique des titres en anticorps et l’analyse de la réponse humorale seront effectués (ELISA, ELISPOT, isotypage, analyse des lavages broncho alvéolaires, recrutements
cellulaires). Enfin, un test d’inhibition de l’hémagglutination sera réalisé.

– Protection contre des infections expérimentales chez la souris : suite à l’étude de la réponse immunitaire, nous utiliserons les doses optimales à administrer par voie intranasale à des souris afin de tester d’une part la réponse anticorps et cellulaire, et d’autre part leur pouvoir protecteur contre un challenge viral homotypique (H1N1 adapté souris) ou hétérotypique (H7N1 aviaire). Les souches utilisées ne sont pas hautement pathogènes dans le cadre de la preuve de faisabilité. Suivi quotidien des souris quotidien : score clinique, courbe de poids, taux de mortalité, température. Suivant les protocoles éthiques, les souris seront euthanasiées, leurs poumons prélevés afin d’en déterminer la charge virale (plages de lyse).

– Etude de la réponse immunitaire chez le poulet : nous opterons en fonction des résultats obtenus en modèle murin pour une procédure immunisante optimale/protection optimale. Les voies d’inoculation (sous-cutanée ou intranasale) seront comparées. Le sang sera prélevé à différents temps post-inoculation et la réponse humorale sera analysée par ELISA.

– Dans le cas d’une prolongation du contrat (18 mois), des épreuves virales impliquant des souches hautement pathogènes (H5N1 Niger 2006) sont prévues en modèle murin et aviaire avec analyse de la charge virale, histopathologie, épreuves sérologiques (Pietrzak et al., 2016, Antiv Res)

Résultats attendus :

– Validation de la plateforme-vaccinale nanoring par voie mucosale contre l’influenza
aviaire à faible coût (production/purification)
– Auto-adjuvation des nanorings grâce à P97C (ou autre adjuvants) afin d’obtenir une réponse robuste et une protection maximale en épreuve virale
– Compétences Recherchées :
– Immunologie (ELISA, cytométrie)
– biologie moléculaire et biochimie (clonage, production de protéine recombinante).
– diplôme d’aptitude à l’expérimentation animale de niveau 2 (expérimentation animale rongeur et infection expérimentale)

Avant tout, une forte motivation pour des projets de recherche finalisés est demandée, tout en sachant que dans le cadre de ce projet nous avons également développés des outils pour aborder l’étude de mécanismes cellulaires plus fondamentaux. Un post-doc a été d’ores et déjà recruté et est en poste depuis le 1er septembre 2017. L’assistant ingénieur travaillera donc en équipe avec le post-doc et viendra en appuis technique de celui-ci dans tous les aspects du travail : biologie moléculaire (clonage et construction de nouveaux nanorings), la production de protéine recombinante (production des nanorings qui seront utilisés dans les challenge vaccinaux) et expérimentation animale (détermination de l’immunogénicité des nanorings vaccinaux en modèle souris et poulet, vaccination et challenge viraux en modèle souris).